Значения других чисел

Значения цифр от 0 до 9

Значения двузначных чисел от 10 до 99

Значения трехзначных чисел от 100 до 999

Значения четырехзначных чисел от 1000 до 9999

15:51 на часах. Ангельская нумерология | Eva Sweden

Некоторые числа вокруг нас несут определенные послания. Наша задача – правильно распознавать и трактовать знаки ангелов. Какое имеет 15:51 на часах значение ангельская нумерология расскажет нам ниже.

Единица трактуется как символ энергии и силы, она направлена на самого человека, его уверенность в себе. Пятерка считается числом удачи.

В целом, 15:51 на часах — это счастливая комбинация, но разберёмся подробнее.

Что означает 15:51 в Отношениях

Если перед началом свидания вы увидели на часах 15:51, то с большой вероятностью встреча пройдёт хорошо, и есть шанс на дальнейшее развитие отношений.

Цифра 15 во времени обещает успех в любви и гармонию.

Также 15:51 на часах значение может трактоваться как то, что вами кто-то очень интересуется и ищет возможность увидеться. Оглянитесь по сторонам, вдруг ваша судьба совсем рядом.

Что означает 15:51 в работе и творчестве

Значение 15:51 растолковывают, как возможность скрытых талантов. Подумайте, что вам хорошо удаётся делать, может быть, стоит заниматься этим делом чаще? Поскольку единица символизирует направленность на личность, 15:51 в ангельской нумерологии может означать раскрытие внутреннего потенциала. Вы можете заметить в себе способности к чему-то новому в этот день. Главное – стараться не упустить шанс реализовать себя.

Что означает 15:51 в финансах и бизнесе

Одно из значений 15:51 на часах связано с карьерой. Вам может светить повышение зарплаты или получение новой должности. В бизнес-делах это число также принесёт удачу. Это может быть заключение выгодной сделки или полезные знакомства. Не бойтесь начинать в такой день новые знакомства и принимать важные решения. Сегодня фортуна на вашей стороне!

Что говорит 15:51 о ваших поступках

Вас можно назвать настоящим счастливцем, если вы увидели время 15:51 значение будет иметь и сочетание замеченное на мобильном телефоне и на часах и на других электронных устройствах. Ангелы дают сигнал, что для вас открыты все возможности. Пробуйте в этот день всё то, что не решались сделать раньше: начать общение с приятным человеком противоположного пола, приготовить новое блюдо, сходить в другой ресторан. Главное – не сомневаться в своих силах, в остальном вам помогут высшие силы.

Вот, что рассказывает девушка, долгое время изучающая ангельскую нумерологию: «Однажды узнав значение 15:51 и заметив эти числа на экране смартфона, моя подруга решила пойти на йогу, хотя всегда была далека от спорта. Там она познакомилась с очаровательным инструктором, с которым у неё завязался роман. Вскоре пара планирует свадьбу, и я уверена, что всё это не просто совпадение. »

15 51 на часах значение: ангельская нумерология

Некоторые числа вокруг нас несут определенные послания. Наша задача – правильно распознавать и трактовать знаки ангелов. Какое имеет 15 51 на часах значение ангельская нумерология расскажет нам ниже. Единица трактуется как символ энергии и силы, она направлена на самого человека, его уверенность в себе. Пятерка считается числом удачи. В целом, 1551 на часах — это счастливая комбинация, но разберёмся подробнее.

Что говорит 15 51 на часах о ваших поступках

Вы являетесь настоящим счастливчиком, если ангелы отправили вам число 15 51. Удача во всем вам сопутствует, и вы идете по жизни вдоль белой полосы.

Людям, которые не решались что-то начать

Вселенная открыла для вас все двери. Сделайте то, на что вам давно не хватало решимости: начните общение с симпатичным вам человеком, попробуйте экзотическое блюдо, совершите экстремальный поступок, запишитесь на йогу. Главное – верьте в свои силы, а в остальном положитесь на ангелов.

Людям, которым необходимо изменить свой взгляд на что-либо

Настало время серьезных перемен в вашем мировоззрении. Если вы стали чувствовать враждебность окружающего мира или видеть вокруг слишком много преград, измените свое отношение к этому, а ситуация изменится следом.

Людям, которым необходимо найти настоящую причину случившихся неприятностей

Нередко мы бываем уверенны, что осознаем проблемы происходящего, однако ангелы утверждают, что это далеко не так. Зачастую определенными постулатами мы маскируем свои страхи и оправдания и уходит от осознания суровой правды о себе.

Людям, которым необходимо помнить, что решения имеют последствия

Высшие силы напоминают, что решение «ничегонеделания» тоже является решением и имеет далеко идущие последствия, с тяжестью которых приходится мириться. Мир движется дальше, а мы остаемся в определенных условиях. Вся разница заключается в том, что условия оказались не нашим выбором.

Что говорит 1551 о ваших поступках

Вас можно назвать настоящим счастливцем, если вы увидели время 15 51 значение будет иметь и сочетание замеченное на мобильном телефоне и на часах и на других электронных устройствах. Ангелы дают сигнал, что для вас открыты все возможности. Пробуйте в этот день всё то, что не решались сделать раньше: начать общение с приятным человеком противоположного пола, приготовить новое блюдо, сходить в другой ресторан. Главное – не сомневаться в своих силах, в остальном вам помогут высшие силы.

Вот, что рассказывает девушка, долгое время изучающая ангельскую нумерологию: «Однажды узнав значение 15 51 и заметив эти числа на экране смартфона, моя подруга решила пойти на йогу, хотя всегда была далека от спорта. Там она познакомилась с очаровательным инструктором, с которым у неё завязался роман. Вскоре пара планирует свадьбу, и я уверена, что всё это не просто совпадение.»

Появление числа 15 51 на часах

Внимание! Зеркальное время 15 51 связано с переменами, опасаться которых не стоит. Все происходящее правильно и своевременно. Вскоре вам понадобится сделать выбор, в противном случае вы сможете оказаться в весьма неприятных ситуациях.

Случайно

Все, что вы раньше считали несбыточным, плавно перетекает в реальность. Люди и обстоятельства не всегда остаются союзниками, но вам под силу с этим справиться. Поражения трансформируются в победы и наоборот.

Постоянно

Наступило время возможностей и осознания своих сильных и слабых качеств. Удача совсем рядом, надо лишь протянуть рук и поймать ее за хвост. Сконцентрируйтесь на командной работе и налаживании отношений с близкими и значимыми для вас людьми. Живите здесь и сейчас, пользуясь всеми имеющимися благами. Стремитесь к получению нового опыта – это принесет вам небывалое удовольствие.

Что значит сочетание 15-51 на часах

Знаки приходят как ответ на внутренний запрос. Вы о чем-то думаете, волнуетесь, переживаете. Возможно, скрываете мытарства от окружения. Но небо способно обойти маленькие хитрости. Ему ведомо, что происходит внутри личности.

Сказать невидимый друг не может. Потому использует доступные способы. Хочет натолкнуть на мысль, приободрить или отругать.

Что означает в любви и отношениях

Оптимистичная подсказка, особенно когда является перед очами часто. Любовная сфера вскоре порадует, засияет радужными всполохами чувств.

Парные поймут, что страсть стала глубже. Взаимности никто не угрожает. Разве что ваши смутные подозрения, обусловленные внутренними комплексами. Срочно избавляйтесь от нехороших наваждений.

Одиночки распрощаются с непарным состоянием. По-видимому, навсегда. Шаловливый Амур уже подготовил стрелу и ждет момента пронзить два сердца. Так и произойдет. Отдайтесь на волю обворожительной романтики.

Помните, что пятнадцать — символ тайного влечения. Покрутите головой по сторонам. Влюбленный персонаж входит в круг вашего повседневного общения.

Значимость в деньгах и работе

Выдвигайте задачи бизнеса на передний план. Настал миг триумфа. Но сама победа на голову не свалится. Активизируйте усилия, используйте оригинальные подходы.

Служащего явно заприметил начальник. Руководитель планирует выдвинуть вас на вакантную должность с более широким кругом полномочий и заработком. Не зевайте, хватайте подарок.

На кону удачное стечение обстоятельств. Конкретика связана с текущими вопросами. Варианты: выгодная сделка, контракт, знакомство, получение информации.

Предназначение в творчестве

Мироздание нуждается в ваших, пока не раскрытых способностях. Побыстрее откапывайте дар. Не отказывайтесь от самореализации в пользу бытовых удобств. Иначе заслужите горькое наказание.

Если видите тандем пять-один постоянно, то ангел возвещает заслуженную славу, известность, богатство. Только реализуйте природные дарования.

Что обозначает в повседневных ситуациях и поступках

Счастливая комбинация работает, независимо от места нахождения. На циферблате или в мобильном устройстве, на чеке или бумажном носителе — это воодушевляющее, подталкивающее значение.

Вариации ангельского намека:

1. Не трусьте, воплощайте задуманное. Все получится отлично.
2. Не упускайте возможность заполучить уважение, успешность, популярность. Пишите, говорите, презентуйте идеи.
3. Сделайте шаг навстречу любви, дружбе, сотрудничеству. Почему бы не проявить активность именно теперь.

Суть послания Высших — рискуйте. Сделайте так, как раньше бы не пришло в голову. Купите лотерейный билет, слетайте на выходные на курорт, отнесите на помойку старые вещи. Не думайте о трудном «завтра». Насладитесь свободным «сегодня».

Какое значение несут числа 1, 5, 15 и 51 в ангельской нумерологии?

Число 1

Единица открывает впечатляющие возможности.

Положительное: независимость, авторитетность, наличие богатого жизненного опыта, уверенность в своих силах, умение объективно оценивать происходящее и использовать свои знания.

Отрицательное: использование своего влияния ради корысти, злоупотребление властью и излишняя самонадеянность.

Число 5

Пятерка символизирует стремление к свободе и отторжение устоев.

Положительное: неординарность, энергичность, тяга к неизведанному и креативное мышление.

Отрицательное: неуравновешенность, импульсивность, склонность действовать ради собственных удовольствий и оказываться в неприятных ситуациях.

Число 15

Важно! Если рядом с вами оказывается это число, значит, вы стали магнитом для удачи. Настало время для достижения целей, при чем задуманное будет осуществляться без особого труда.

Тайный смысл и символизм цифр 15 51 на часах

Главное, что стоит учесть — числа ангелов уникальны, поэтому увидеть их может далеко не каждый смертный. Такая комбинация чисел попадается редко, а если и преследует вас, то это точно не простое совпадение, и стоит ждать крупного везения! Это свидетельствует о том, что ваш хранитель решает протянуть руку помощи в данный момент.

Возможно вы думаете, что ангелы посылают нам собственные знаки. Послания они делают в виде чисел, либо времени. Причем во вторник (это закономерность). Например, 1551 на часах. Разобрав значение знака, можно определиться, что хочет от вас ангел с помощью нумерологии.

Постарайтесь понять такое число игнорировать нельзя вовсе, а изменения, которые оно символизирует, способны перенести вашу жизнь на новые рельсы.

Какие приметы и значения несут цифры 1551, если вы часто видите их

15:51 — это зеркальное время на ваших часах. То есть цифры с обеих сторон одинаковые, хоть и отражены зеркально. Чтобы понять смысл обозначения, необходимо расшифровать каждую циферку по отдельности.

Как писала Дорин Верче, единица символизирует лидерство, ведь не зря она стоит самой первой в ряду. Появится возможность продемонстрировать свои лидерские качества, но вместе с этим придется нести ответственность за коллектив.

Хороши значения единицы: независимость от других людей, наличие авторитета. Вы реализуете свои потребности самостоятельно, основываясь на жизненном опыте.

Отрицательные значения единицы: риск возникновения жажды власти, соблазна злоупотреблять своим высоким положением. Также высока вероятность появления у самоуверенности, что может привести к плачевным последствиям.

Такая значимая цифра как 5 присуща тем, кто стремится к свободе от различных запретов и правил. Но не следует думать, что человек склонен к нарушениям закона и противоправным деяниям.

Хорошие значения пятерки: решительность, стремление к активным действиям. Носитель этой цифры как будто полон неисчерпаемой, негасимой энергии, любознательности и инициативы. Имеется четко поставленная цель, которой он пытается добиться.

Отрицательные значения пятерки: излишняя динамичность и бойкость, смена ориентира действий. Человеку присущ чрезмерный фанатизм при достижении цели. Окружающим кажется, что у него нет чувства ответственности, однако это не так.

Обратите внимание: цифра 5 предупреждает, что человек готов на всё ради того, чтобы добиться своего. Это грозит частым попаданием в неловкие, а порою довольно проблемные, ситуации. Но сильно переживать не стоит. Он легко выпутается из всех проблем, которые сам себе создал.

Значение числа 15 51 для любви и отношений

В любовных отношениях, вы можете насытиться совместным проведением времени с вашей половинкой, разделяя как хорошие моменты, так и плохие. Не стоит смотреть на мелкие проблемы. В этом нет абсолютно никакого смысла.

Увидев 15 51 на часах, вы можете определить человека, который является подходящим для вас. Это значит, что вы имеете все возможности быть счастливым именно с ним, проживая яркие годы.

Не находитесь в отношениях? Обратите внимание на совпадение чисел на ваших часах. Они позволят сосредоточиться на том, кто действительно будет иметь большое значение для вас. Не исключено, что вы потеряли массу времени на лишних в вашей жизни людей.

Естественно, ангелы возьмутся помогать. Они не покинут в трудную минуту. Достаточно принять число 15 51. И, как вы понимаете, оно действительно способно принести множество замечательных событий. Это позволит вам не только найти удовлетворение в вашей любовной потребности, но и отыскать себя.

Как научиться распознавать знаки ангела-хранителя

Вы, может быть, станете сомневаться в том, что здесь написано, и имеете на это право. У любой живой души на земле есть божественный указатель, либо как изъясняются люди, ангел-хранитель. Мы каждый день от него принимаем какие-либо подсказки. Как же научиться определять знаки ангела, а также доверять своей интуиции?

В таком случае мы осознаем, что именно свыше нам регулярно помогает. Однако из-за наших забот, загруженности, трудностей, беспокойств, мы не видим такие знаки. Но они с нами повсюду! Ответ на свой вопрос можно получить всегда, в различных местах, ситуациях. Давайте разберем, какие бывают подсказки свыше и как их распознавать.

Зрительные

Данную подсказку вы сможете заметить глазами. Как пример, у вас не получается решиться на что-либо, тогда вы размышляете, волнуетесь, и вдруг раскрыв газету, видите в ней комбинацию чисел 1551. Вам представлен сигнал свыше о том, что надо поступать непосредственно так, а не по-другому! Вы можете заметить эти цифры и на щите с рекламой, раскрыв книжку, и на остановке. Но не следует намеренно отыскивать подсказку, вдумчиво читая текст, это происходит как бы случайно.

Визуальные подсказки возможно заметить непосредственно в ликах природы. Например, тучи, листочки деревьев, цветы.

Слуховые

Данную подсказку можно услышать по радио, ТВ, из какой-либо фразы, принесённой ветром, звучание песни и т. п. Самое важное – тут нужно не просто вслушиваться, а необходимо расслышать, какой сигнал вам подается свыше.

Интуитивные

Существует мнение, что интуиция – это если ваша душа беседует с Господом, и в этом имеется часть истины. Попросту доверьтесь высшим силам, а также прислушайтесь к собственным чувствам, но не к разуму. Случается порой так, что интуиция подсказывает необходимость совершить то или иное действие таким образом, а не по-другому. Это необъяснимо, поэтому мы и думаем, что нужно сделать только так, а не иначе.

В виде образов

Аналогичные жизненные подсказки прибывают к нам во снах, и их не следует игнорировать! Случается так, что снятся ясные, как наяву сны, какие производят большое впечатление и сохраняются в памяти на продолжительный период и на долго впечатляют. Это всё – сигналы свыше. Периодически людям снятся вещие сны. В основном тем, кто открыт душой собственным ангелам-хранителям и доверяет божественным силам.

Когнитивные

Данные знаки – происшествия в жизни человека, они стремятся доставить нам важные сведения. Чтобы вы могли правильнее их распознавать, приведем пример.

Одна женщина, когда была юной, увлеклась «нехорошим» юношей. Ей в то время интуиция подсказала, что не нужно с ним встречаться. И ее родня, приятели говорили то же самое. Однако она была упрямая и не прислушивалась ни к чьему мнению, хоть в душе осознавала, что они правильно говорят. Как-то раз, идя к нему на встречу, девушка подвернула ногу. Было больно, однако она всё же шла к нему, несмотря на то, что был знак свыше: «Не нужно ходить!». Позже ничего хорошего с этим молодцем у девушки не было, парень совершил немало подлостей, от каких она в течение продолжительного времени пыталась прийти в себя.

То, что произошло с нею – когнитивный сигнал. Такие знаки ангелы-хранители подают редко, только тогда, когда на прочие жизненные подсказки мы совсем не откликаемся.

Поэтому для того, чтобы распознавать, разбираться в тех сигналах, с помощью которых нас пытаются предостеречь свыше, в первую очередь, необходимо в это поверить. А еще – уметь отвлекаться от обыденной суеты, прекращать частые размышления в голове. Нужно не просто оглядываться по сторонам, но и различать эти знаки. Также надо не только вслушиваться в окружающие звуки, а уметь их услышать, почувствовать. Когда вы станете жить осмысленно, то несложно этому научиться.

Значение 15.51 на часах — ангельская нумерология

Замечаете, что в вашей жизни часто встречаются одинаковые цифры? Например, глядите на часы и понимаете, что это часто происходит ровно в 21.21? Думаете, случайность? А вот американский психолог и оккультист Дорин Верче разработала целую концепцию предсказаний – ангельскую нумерологию, доказывающую отсутствие случайностей и подчиненность закономерностям.

Значение 15.51 на часах – послание ангелов

Основная концепция ангельской нумерологии заключается в том, что описанные выше закономерности, касающиеся цифр, являются посланиями высших сил. У каждого человека есть ангел, пытающийся повторением цифр донести до подопечного информацию. Это сведения разного рода, в том числе и о будущем.

Не все цифры, окружающие нас, одинаково значимы. В учении Дорин Верче имеют значение лишь парные (24.24), зеркальные (23.32) и строенные (777) комбинации.

15.51 – «зеркальное число»: показатель времени, в котором количество часов и количество минут как бы «перевернуты» относительно друг друга и образуют цифровой палиндром.

Цифровые перевертыши, случайно замеченные на циферблате обозначают, согласно ангельской нумерологии, намек на возможное развитие событий в будущем.

Чего стоит ждать в будущем?

Значение цифр 15.51 на часах может истолковываться в личном и в профессиональном плане. В целом, если вы посмотрели на часы и случайно обнаружили на циферблате данную числовую комбинацию, прогноз на будущее трактуется как положительный, но с оговорками.

Семья и отношения

Время 15.51 имеет значение романтических взаимоотношений. Для мужчин оно означает бурную страсть, не перерастающую в глубокие постоянные чувства. Роман, полный эмоций, стремительно начавшийся, закончится быстро.

Для женщины подобная комбинация 1 и 5 свидетельствует о бурных чувствах, которые, возможно, перетекут в постоянные взаимоотношения, если обстоятельства – совместимость по характерам, общие интересы – тому поспособствуют.

Разумеется, это лишь намек. Оглянитесь вокруг: возможно рядом находится человек, способный подарить страсть и романтику, пусть непродолжительную, но яркую и запоминающуюся.

Работа и карьера

Цифры 15.51 на часах имеют и значение, связанное с карьерой. В данном случае все одинаково хорошо для мужчин и женщин. Возможны:

• повышение зарплаты;
• новая выгодная должность;
• интересная работа, совпадающая с хобби.

Так что, если разосланное вами резюме не привлекло потенциального работодателя, нет повода отчаиваться.

Намек истолковывается и как удача частного характера. Возможен лотерейный билет, купленный без особой надежды на выигрыш и вдруг сорвавший джек-пот.

Как себя вести в окружении повторяющихся цифр?

Повторяющиеся комбинации цифр записывайте, занимайтесь интерпретацией результатов в спокойной обстановке.

Не бойтесь и не паникуйте, даже если цифры четко говорят о предстоящих неприятных событиях. Успокойтесь, разберитесь в себе и окружающих. Примите меры по устранению проблемы.

Мысленно не ленитесь благодарить небесного заступника, доносящего до вас – пусть даже не конкретно, а намеками – информацию, имеющую значение для вашей жизни. Чувство защищенности – то, что привносят в жизнь ангельская нумерология, а это дорогого стоит.

При использовании ангельской нумерологии появляется искушение повлиять на результат. Однако строго запрещено. Не стоит предпринимать шагов:

1. Искать тайный смысл в любых комбинациях чисел. Его нет. Значимы сочетания чисел – только повторяющиеся, перевернутые и тройные. Остальные ни о чем не сигнализируют.
2. Сверять часы с точным временем. Ангел-хранитель ориентируется на ваш ритм жизни, даже если часы спешат или отстают. Поэтому смотреть, «который час на самом деле» с целью получить благоприятный знак, не имеет смысла.
3. Специально смотреть на часы в ожидании наилучшего послания от высших сил. Значимое соотношение чисел обязательно случайно. Подстерегать момент его появления – значит лишать себя возможности узнать будущее.

Итак, если вести себя аккуратно и полагаться на случай, вполне возможно получить послание – намек или предостережение от высших сил. А если увидите на часах цифры 15.51, ждите, как минимум, любовных приключений и прибавку к жалованью.

15:51 значение на часах в ангельской нумерологии, трактовка

Когда вы видите число 15:51 на часах это может быть послание от ангела, что вскоре придется принять важное решение. Решение, которое изменит вашу жизнь. Но эта комбинация может иметь больше значений, рассмотрим значение цифр 1551 ниже

В каком случае видеть 15 51 на часах – получить подсказку

Возникает вполне логичный вопрос, в каком случае видеть 15 15, значит получить послание от ангела.

Если вы видите данные цифры не однократно, то это скорее всего знак вам от ангела. Вы можете увидеть эти цифры не только на часах, но и в других местах.

Когда вы увидите ангельскую подсказку, обратите внимание на то, что вы делали, или, может быть, даже на то, о чем вы думали, когда увидели цифры. Эти знаки всегда открываются в контексте, призванном помочь понять их.

Например, число ангела 1551 может говорить вам…

Что означает число 1551 в ангельской нумерологии в любви?

Когда дело касается любви, число 1551 может говорить о том, что вы оставляете что-то недосказанным. Страх или неуверенность заставляют сдерживать себя. Возможно, вы никому не рассказываете о своих чувствах. Или боитесь задать важные вопросы.

Число 15 15 также может символизировать разговор. Чем дольше его откладываешь, тем труднее будет. Вам необходимо предпринять шаги, чтобы избавиться от бремени, которое несете. Ангелы хотят сказать, что последствия будут не такими страшными, как вы представляете.

Значение 15 51 на работе и в профессиональной сфере

С точки зрения работы, данная комбинация может быть указанием на повышение в должности или увеличение зарплаты. Обратите внимание на новые знакомства, они могут в дальнейшем стать полезными. Если у вас свое дело, то возможно получение прибыли в скором времени. Если вы часто видите 1551, то скорее всего примите правильное решение.

Значение 1551 в творчестве

Задумайтесь, что вы можете делать хорошо, но никогда не обращали на это внимание. Комбинацией 1551 ангелы хотят указать на наличие скрытого таланта, который пора проявить миру. В ангельской нумерологии 15 51 указывает на необходимость открытия нового потенциала. Внимательно наблюдайте за своими действиями.

Значение 15 51 в поступках

Значение этой комбинации может быть разным, рассмотрим подробнее, какие подсказки дают ангелы ниже.

Измените свое отношение

Число 1551 может иметь в ангельской нумерологии значение, близкое к числу 8888, вы можете увидеть его , когда необходимо серьезно изменить свой взгляд на что-то. Возможно, вы чувствуете, что мир против вас, или ощущаете слишком большое количество препятствий вокруг. Комбинация позволяет понять, что все это в вашей голове. Измените отношение, а ситуация изменится вслед.

Получение отказа в чем-то — это не неудача, это значит, что вам следует прекратить попытки. Возможно то, что вы желаете получить не нужно вам на самом деле. Если на ваши чувства не отвечают взаимностью, это не значит, что вы не достойны, возможно просто не пришло нужное время или рядом не подходящий человек. Следует дождаться того, кто сможет полюбить вас так, как вы этого заслуживаете.

Найдите настоящую причину

Часто мы думаем, что можем точно определить, в чем проблема. Например, вы не можете подать заявление на работу за границей, так как нужны своей семье. Возможно не можете продвинуться по карьерной лестнице потому, что босс ненавидит вас.

Но числом 1551 ангелы предлагают задуматься, а так ли все на самом деле. Являются ли выше перечисленные утверждения реальностью или это оправдания, которые вы используете, чтобы замаскировать собственный страх?

Говорили ли вы со своей семьей о возможности путешествия, о том, что они думают по этому поводу и что они будут делать? Откуда вы знаете, что вы не нравитесь начальнику? И вообще может ли конкретный человек повлиять на ваше развитие? Очень часто мы ищем оправдания, а не признаем суровую правду о себе.

Решение ничего не делать – это тоже решение

Число 1551 на часах, отчасти, как и число 0909, может быть напоминанием о том, что решение ничего не делать — это тоже решение. Это может быть решение не помогать. Возможно, это решение позволить кому-то другому выбирать вам жизненный путь, профессию. Это может быть решение остаться на том же месте. Эти решения также имеют последствия, и вы должны смириться с тяжестью последствий, если решили ничего не делать.

Помните, когда вы решаете ничего не делать, вы не остаетесь в той же самой позиции. Мир вокруг вас все еще движется, поэтому вы все равно приходите к определенным условиям. Разница в том, что эти условия выбирали не вы.

Число 1551 в нумерологии

Число 5

Число 1551 представляет собой пару пятерок, важность этого числа подчеркивается его двойным повторением.

Цифра 5

Цифра 5 символизирует нашу независимость, свободу и тягу к приключениям.

Оно может иметь очень простое значение: сейчас самое время отправиться в путешествие или какое-то другое приключение. Однако чаще это означает, что вашей независимости каким-то образом мешают, и вам нужно что-то делать, чтобы вернуть ее.

Возможно вы чувствуете, что не можете действовать или говорить из-за кого-то другого. Или ваши собственные страхи и неуверенность заставляют чувствовать себя в ловушке. Вам нужно стать смелее, чтобы развиваться дальше.

В колоде Таро данное число связано с картой Иерофанта, человеком, который сам принимает решения и принимает на себя их последствия.

Число 1

Эта пара пятерок находится между парой единиц, образуя своего рода ворота, через которые мы должны пройти, чтобы получить независимость. Разделенная таким образом пара единиц часто означает, что нужно принять решение, которое приведет вас к точке невозврата.

Цифра 1 — это всегда призыв к действию. Это напоминание вам, что вы формируете жизнь своими действиями и отношением. Возможно вам стоит рассматривать неудачи как возможности.

Число 3

Число 1551 также имеет энергии тройки, так как 1 + 5 + 5 + 1 = 12, что в дальнейшем сокращается до 1 + 2 = 3. Это цифра общения.

Возможно вы должны начать решать ваши проблемы с улучшения навыков общения. Возможно вы стесняетесь с кем-то разговаривать, либо наоборот слишком высокомерны и вас не заботят другие люди во время общения.

За время 15:51 на часах отвечает ангел Михаил. Этот хранитель отвечает за любовь и ваши предчувствия. Этот ангел обостряет чувства, чтобы помочь лучше понять, что вокруг происходит.

Так как это ангел отвечает за любовь, то послание может в большей степени быть связанно с данной сферой жизни. Ваш ангел-хранитель дает вам понять, что он принесет любовь, мир и верность в ваши отношения. Он подарит вам гармонию и душевное равновесие. Если вы в ссоре, попытается примерить с партнером или близким. Также этот ангел может намекать на скорое пополнение в семье, если вы этого жаждите.

Также этот ангел призывает вас думать творчески, позитивно. У вас большой потенциал, но важно применять его в правильном направлении.

Что делать, если вы видите число ангела 1551

Когда вы видите число ангела 1551, знаете, что предстоит принять важное решение. Это одно из тех решений, которые меняют жизнь. Потом ничего не будет прежним.

Числом 1551 ангел предупреждает вас о том, что страх, низкая самооценка или убеждения ограничивают вас и мешают свободно принимать правильные решения.

Лера Самойлова

С детства увлекаюсь нумерологией. Давайте вместе разгадывать тайны и смысл чисел.

Задать вопрос

15:51 — Значение

Хотя многие из нас не знают об этом, нас окружает невидимый мир ангелов, которые служат нашими проводниками и защитниками от зла ​​и вреда.

Нас учат верить только в то, что мы можем видеть и чувствовать, и идея о некоторых невидимых существах, которые могут помочь в нашей жизни, обычно кажется невозможной и малоприемлемой для большинства людей.

Независимо от наших убеждений, эти существа существуют и всегда готовы помочь. Они остаются в стороне, следя за тем, чтобы не вмешиваться в нашу жизнь, уважая нашу свободную волю, если только их действия не являются абсолютно необходимыми.

Когда они все же решают связаться с нами, они обычно делают это с помощью знаков и символов. Они тщательно выбирают свои сообщения и знаки, которые они будут использовать, чтобы донести их до нас. Затем они следят за тем, чтобы мы видели знак или символ достаточно раз, чтобы понять, что это нечто большее, чем просто совпадение.

Большинство из нас пережили похожие события, и многие из нас не задумывались о них. К сожалению, многие люди отказываются верить в то, что странные совпадения, которые они переживают, имеют какой-то смысл.

Наши ангелы-хранители часто используют числа и часы, чтобы привлечь наше внимание. Основная причина в том, что числа имеют особое значение, которое они используют как сообщение для нас.

Когда вы начинаете видеть одни и те же числа повсюду или смотрите на часы в одно и то же время день за днем, это нормально, что вы задаетесь вопросом, имеют ли эти события какое-то особое значение для вашей жизни. Они есть, и вам не следует игнорировать их, даже если вы можете быть напуганы или сбиты с толку тем, что происходит.

Наши ангелы-хранители настойчивы, и они не сдадутся, если мы не торопимся, чтобы выслушать их послание. Они продолжают показывать нам один и тот же знак, пока мы не сдадимся и не начнем искать его значение.

Иногда это длится недели, месяцы и даже дольше. Сообщение, которое вы получите в ближайшее время, призвано помочь вам, а не навредить вам. Вы будете удивлены его точностью и необходимостью в ваших текущих жизненных обстоятельствах.

Они появляются в нашей жизни всякий раз, когда мы нуждаемся в руководстве, поддержке, совете, предупреждении, спасении от опасности, а в некоторых случаях только в поощрении продолжать путь, который мы выбрали.

Если вы продолжаете видеть час 15:51, в вашем случае, это ваш знак от ангелов и Вселенной. Вы нашли нужную страницу. Мы рассеем для вас туман и ответим на многие ваши вопросы.

15:51 Зеркальный час — Символизм и значение

Час 15:51, который вы видите в наши дни, а может и дольше, — это так называемый перевернутый зеркальный час.

Эти часы имеют одинаковые числа в часах и минутах, отражающие друг друга, только в этом случае они перевернуты, а не в точности отражают друг друга.Эти часы обладают огромной силой и являются важным посланием Вселенной и ваших ангелов-хранителей. Они пытаются ответить на некоторые ваши вопросы или на чем-то отвлечь ваше внимание.

Иногда они хотят только сообщить вам о своем присутствии и рассказать вам об их защитной роли в вашей жизни.

В случае перевернутого зеркального часа 15:51 речь идет о любви, свободе, оптимизме, счастье, благотворительности, гуманизме и т. Д. Зеркальный час 15:51 может быть знаком того, что в вашей жизни скоро произойдут серьезные изменения.

Ангелы хотят, чтобы вы знали, что вы получите их поддержку при прохождении этих изменений и во всех решениях, которые вы будете вынуждены принять.

Этот зеркальный час может появиться в вашей жизни, когда вы чувствуете себя одиноким или подавленным из-за неправильного выбора, который вы сделали в прошлом. Это побуждает вас не беспокоиться об этом и как можно больше наслаждаться нынешними обстоятельствами. У вас есть свобода, и это больше, чем многие люди могли бы надеяться.

Этот зеркальный час — это послание ваших ангелов-хранителей, чтобы они с нетерпением ждали хороших вещей в будущем, а также наслаждались настоящим моментом.Мы все творцы своей судьбы, и мы должны быть в состоянии принять на себя ответственность за свои действия, которые привели нас туда, где мы находимся.

Какими бы ни были наши текущие обстоятельства, зеркальный час 15:51 — это знак того, что мы не должны зацикливаться на них, а с радостью принимать их и пытаться наслаждаться ими и извлекать из них максимум удовольствия.

Гнев, депрессия или аналогичные негативные чувства только удерживают вас в бесконечном кругу негатива.

Единственный способ выйти из этого круга — быть счастливым и оптимистично настроенным там, где вы находитесь, и с тем, что у вас есть.Никто не может нести ответственность за ваше счастье или несчастье.

Тебе нужно сделать себя счастливым. Вам нужно добровольно выбрать это состояние.

Что 15:51 означает духовно?

Зеркальный час 15:51 несет послание любви, а также интуитивного ощущения того, что произойдет. Этим часом правят ангелы-хранители Михаил, властитель любви и предчувствия.

Этот ангел-хранитель поможет вам обрести или развить способность видеть будущее и ясновидение.Вы сможете заглянуть в будущее, когда вам понадобится какая-то информация.

Этот зеркальный час также является знаком вашей интимной жизни и отношений. Этот зеркальный час объявляет о долгожданных изменениях в этой области, которые грядут в вашу жизнь. Вы можете ожидать любви, гармонии, мира, равновесия и стабильности в личной жизни.

Для тех, кто какое-то время не замужем, этот знак указывает на то, что в их жизнь войдет кто-то новый. Для тех, кто находится в разлуке со своим любимым человеком из-за ссоры или непонимания, этот час объявляет примирение и разрешение всех споров.

Зеркальный час 15:51 — знак роста, рождения, плодородия, размножения. Это может означать расширение вашей семьи и рождение ребенка или становление родителем. Это привносит страсть в отношения с вашим партнером.

Это сообщение может быть знаком, чтобы представить результат ваших желаний, как если бы они уже материализовались. Это поможет привлечь их в вашу реальность. Ваши вибрации помогут вам проявить свои желания.

Убедитесь, что вы только представляете наилучший возможный результат и избегаете негатива во всех его формах.Таким образом вы очистите пространство для своих желаний, которые войдут в вашу жизнь. Важно не перегружать себя своим прошлым, особенно если оно болезненно.

Если вы сделаете это, вы будете застрять в прошлом, не позволяя себе получить то, что вы действительно желаете. Все, о чем мы думаем больше всего, материализуется в нашей реальности, никогда не забывайте об этом.

Ангел-хранитель Михаил посылает вам час перевернутого зеркала 15:51 в знак его поддержки и ободрения для больших мечтаний.Верьте, что вы можете достичь всего, что только можете вообразить.

И ты будешь. В этом квесте вас поддержат Вселенная и ангелы.

15:51 в Астрологии и нумерологии

Наши ангелы-хранители и Вселенная часто выбирают числа и часы для своего общения с нами, и основная причина заключается в том, что это самый простой способ передать свое послание, потому что каждое число имеет определенное значение.

Обратный зеркальный час 15:51 представляет собой комбинацию чисел 1, 5, 15, 51, 66 и числа 3 как сумму всех этих цифр (1 + 5 + 5 + 1 = 12 = 1 + 2 = 3).

Число 1 — это успех, прогресс, инициатива, амбиции, лидерство, независимость, свобода, индивидуальность, новые начинания,

Число 5 — это ряд изменений, особенно важных жизненных решений и изменений, выбора, находчивости, свободы, индивидуальности, приспособляемости, независимости, приключений и т. Д.

Число 15 — это число семьи, воспитания, заботы, защиты, служения и служения другим.

Человек, находящийся под влиянием числа 15, часто ориентирован на семью и защищает, но обладает некоторой долей приключений и независимости и любит сохранять часть своей свободы.Они хотят наслаждаться жизнью в полной мере, поэтому они стараются сделать свою жизнь как можно более интересной, и часто их семья является частью этого приключения.

Число 51 — это число, которое символизирует ответственность, находчивость, новаторство, семью, заботу и защиту. Он также символизирует любопытство. Этот человек склонен заботиться о других и больше заботится о благополучии других, чем о собственном благополучии.

Число 66 — это число семьи, гуманизма, общности, благодарности, веры, веры в божественную и безусловную любовь.Это число — знак доверия Вселенной, ее помощи и поддержки. Это поддержка ваших ангелов-хранителей в достижении ваших величайших желаний и целей.

Число 3 — это число роста, оптимизма, навыков, расширения, общения, смелости, творчества, веры, проявления, надежды, интеллекта, энтузиазма, талантов, непредубежденности, стабильности и т. Д.

Число 1551 представляет собой комбинацию этих энергий. Это указывает на необходимость сохранять оптимизм независимо от текущих обстоятельств.Какими бы трудными ни казались сейчас вещи, ничто не длится вечно, потому что изменения — единственная реальность, которая существует.

Все меняется, в том числе и мы. Важно обрести в жизни свой покой и гармонию, максимально уравновесить ее.

Сосредоточьтесь на себе и своих потребностях и не беспокойтесь о завтрашнем дне. Что важно, так это жить сейчас в настоящем моменте и быть полностью довольным тем, что у вас есть. Это нормально иметь желания и цели, которые вы хотите осуществить, но урок этого числа, появляющегося в вашей жизни, заключается в том, чтобы быть счастливым сейчас, в этот момент.

Этот номер просит вас отказаться от всего негативного контента и сосредоточиться только на том, что вас вдохновляет и делает вас счастливыми.

Вам нужно проявить оптимизм и ожидать только лучшего. Это ряд воплощений ваших желаний в реальность. Вам нужно только верить, что они возможны.

Верьте в свою способность наяву обладать тем, о чем вы только мечтаете. Если вам удастся сохранить это убеждение и отношение, очень скоро вы увидите материальные результаты своих усилий.

Это число напоминает нам об уважении к истинным ценностям в жизни, к себе, своей семье и близкому сообществу.Это внушает чувство любви и сострадания. Часто это знак служения тем, кого любишь.

Иногда это число означает признание любви, входящей в вашу жизнь, или установление гармонии в ваших отношениях. Это знак того, что вам нужно отбросить все свои заботы и просто наслаждаться жизнью как есть, веря, что все будет хорошо.

Что делать, если вы видите 15:51?

Если вы очень часто видите обратное зеркало в час 15:51, это хороший знак и не о чем беспокоиться.

Ваши ангелы-хранители связываются с вами, чтобы передать вам послание оптимизма, счастья и исполнения ваших желаний. Вам нужно набраться терпения и думать только о положительных и оптимистичных мыслях, независимо от текущих жизненных обстоятельств.

Этот зеркальный час, появляющийся в вашей жизни, — знак того, что вы скоро начнете переживать, как ваши желания воплощаются в реальность.

Краткое описание

Обратный зеркальный час 15:51 — отличный знак Вселенной.

Это знак удачи, счастья и проявления ваших желаний. Это напоминает отпустить негатив и сосредоточиться только на хорошей стороне вещей.

При спонсорстве

Еще интересные статьи:

Optimux-1551

% PDF-1.6 % 7126 0 объект > эндобдж 7154 0 объект > эндобдж 7112 0 объект > поток Acrobat Distiller 5.0 (Windows) 168-200-02 / 062006-02-02T14: 51: 36 + 02: 002008-07-23T13: 20: 42 + 03: 002008-07-23T13: 20: 42 + 03: 00 Acrobat PDFMaker 5.0 для Wordapplication / pdf

Часовой ген Bmal1 подавляет подвижность макрофагов, фагоцитоз и ослабляет защиту от пневмонии

Значение

Циркадные часы широко регулируют физиологию, с возрастающей ролью в иммунитете.Развитие, прогрессирование и разрешение бактериальной инфекции зависят от времени суток, но механизм неизвестен. Здесь мы показываем, что время суток регулирует фагоцитоз макрофагов, и что за это отвечает основной тактовый белок BMAL1. BMAL1 регулирует RhoA-зависимую подвижность макрофагов и поглощение бактериями, а потеря BMAL1 усиливает антибактериальный иммунитет. Мы идентифицируем генетическую цепь, связывающую связывание BMAL1 с подвижностью, экспрессией генов цитоскелета и активацией RhoA. С ростом устойчивости к противомикробным препаратам поиск новых способов повышения иммунитета путем воздействия на компоненты часов открывает новые терапевтические возможности.

Abstract

Циркадные часы регулируют многие аспекты иммунитета. Бактериальные инфекции зависят от времени суток, но механизмы остаются неопределенными. Здесь мы показываем, что потеря основного тактового белка BMAL1 в макрофагах обеспечивает защиту от пневмококковой пневмонии. У инфицированных мышей наблюдается как снижение потери веса, так и более низкая бактериальная нагрузка в циркулирующей крови. Исследования фагоцитоза макрофагов in vivo выявляют повышенное потребление бактерий после делеции Bmal1 , что также наблюдалось in vitro.Макрофаги BMAL1 ^{— / —} демонстрируют заметные различия в организации актинового цитоскелета, фосфопротеома, обогащенного для изменений цитоскелета, с пониженным содержанием фосфокофилина и повышенным активным RhoA. Дальнейший анализ макрофагов BMAL1 ^{— / —} выявил измененную морфологию клеток и повышенную подвижность. Механически BMAL1 регулировал сеть генов клеточного движения, 148 из которых находились в пределах 100 т.п.н. от сайтов связывания BMAL1 с высокой степенью достоверности. Были идентифицированы связи с функцией RhoA с 29 генами, влияющими на экспрессию или активацию RhoA.Ингибирование RhoA восстановило фенотип фагоцитов до фенотипа, наблюдаемого в контрольных макрофагах. Таким образом, мы идентифицируем неожиданное усиление антибактериальной функции из-за потери BMAL1 в макрофагах, связанной с RhoA-зависимым изменением цитоскелета, увеличением подвижности клеток и усилением фагоцитарной функции.

Регулярный 24-часовой цикл окружающей среды, вызванный вращением планеты, привел к эволюции циркадных ритмов практически у всех форм жизни на Земле. Они управляются автономными клеточными биологическими часами, которые координируют физиологию и поведение в течение дневного и ночного цикла.У млекопитающих многие физиологические системы регулируются в зависимости от времени суток. Включенный в это, иммунитет млекопитающих строго регулируется циркадным часовым механизмом, определяющим величину и характер как врожденных, так и приобретенных реакций (1). В частности, у макрофагов есть сильные эндогенные циркадные часы, которые управляют воспалительной функцией (2-4). Ранее мы определили роль циркадных часов в регулировании вариаций времени суток в исходах после пневмококковой инфекции (5), но ответственные механизмы остаются неизвестными.

Основной клеточный циркадный кардиостимулятор у млекопитающих колеблется с 24-часовым периодом и состоит из положительного плеча, содержащего гетеродимерные факторы транскрипции BMAL1 / CLOCK, которые управляют транскрипцией репрессорных генов периода и криптохрома . По мере накопления белков PERIOD и CRYPTOCHROME они подавляют функцию трансактивации BMAL1 / CLOCK. Кроме того, BMAL1 / CLOCK управляет экспрессией второй репрессорной цепи, состоящей из орфанных ядерных рецепторов REVERBα и REVERBβ.Они, в свою очередь, подавляют экспрессию гена Bmal1 . Помимо основной циркадной петли обратной связи транскрипции-трансляции, факторы транскрипции основных часов действуют через управляемые часами гены, регулируя многие аспекты физиологии, включая энергетический метаболизм и иммунитет (6).

Многие клетки врожденной иммунной системы имеют внутренние часы, включая моноциты, макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, эозинофилы и естественные клетки-киллеры (2, 7⇓⇓⇓⇓⇓ – 13). Эти клеточно-автономные ритмы управляют аспектами дифференцированной функции клеток, включая производство цитокинов, их транспортировку и фагоцитоз.В миелоидных клетках основной циркадный ген Bmal1 оказывает широкий противовоспалительный эффект, опосредованный в значительной степени за счет регуляции транскрипции Reverbα и Reverbβ (3, 14, 15). Также были выявлены дополнительные прямые эффекты Bmal1 в макрофагах (16, 17). Например, специфические бактериальные инфекции показывают зависимость результата от времени суток, включая кишечную Salmonella typhimurium (18) и Streptococcus pneumoniae (5).

Инфекционные болезни являются причиной многих смертей как в развитых, так и в развивающихся странах, а в случае пневмонии на них приходится 5% всех смертей в Соединенном Королевстве (19). Появление бактерий с множественной лекарственной устойчивостью заставляет нас лучше понять механизмы, лежащие в основе инфекции, чтобы определить новые терапевтические стратегии. Роль циркадной биологии в патогенезе бактерий еще предстоит полностью изучить. Это важно, поскольку в настоящее время существует несколько соединений, которые могут изменять ключевые циркадные пути, а также подавлять или усиливать циркадные амплитуды.Одним из ключевых механизмов, определяющих патогенность организма, является фагоцитоз.

Фагоцитоз — это процесс поглощения клетками крупных частиц, основанный на перестройке цитоскелета актиновых микрофиламентов. Макрофаги и нейтрофилы являются типичными клетками, которые выполняют эту функцию у млекопитающих и полезны для защиты хозяина от бактериальных патогенов. Поглощение частицы через рецепторы клеточной поверхности для иммуноглобулинов или комплемента активирует малые GTP-связывающие белки семейства Rho со специфичностью последующего связывания.Например, RhoA активируется рецептором комплемента, но не рецептором FcγR. В своем активном, связанном с GTP состоянии, RhoA взаимодействует с последующими нижестоящими эффекторами, чтобы управлять реорганизацией F-актина. Предыдущая работа предполагает, что ex vivo синхронизированные макрофаги обнаруживают зависимые от времени изменения в фагоцитозе и уничтожении бактерий S. typhimurium (20). Однако роль циркадных часов и их компонентов в регуляции фагоцитоза и влияние, которое они оказывают на бактериальные реакции in vivo, остаются неопределенными.Здесь мы идентифицируем значительное усиление пневмококкового иммунитета в результате потери основного тактового белка BMAL1 в макрофагах. Это сопровождалось увеличением движения макрофагов и фагоцитоза, но не изменением инфильтрации иммунных клеток в инфицированное легкое. Наиболее ярким изменением стала защита от бактериемии (распространение инфекции на кровоток). Дальнейший анализ выявил усиление активности RhoA и кофилина, сопровождающееся значительной реорганизацией актинового цитоскелета.Этот фенотип увеличения функции макрофагов был обращен низкими концентрациями специфического ингибитора RhoA CT04.

Результаты

Предыдущая работа идентифицировала циркадный контроль воспалительной реакции легких на острую стимуляцию липополисахаридом в аэрозольной форме (5). Кроме того, это исследование продемонстрировало вариабельность исходов от пневмококковой пневмонии (наиболее распространенной формы пневмонии) в зависимости от времени инокуляции.Время суток влияет на фагоцитарную функцию макрофагов ex vivo (21, 22), предполагая автономный макрофагами циркадный контроль фагоцитоза. Поэтому, чтобы изучить роль циркадных часов в миелоидной системе в иммунитете легких против инфекции, мы использовали мышей, у которых отсутствует компонент основных часов Bmal1 в миеломоноцитарных клетках ( LysM — Bmal1 ^{— / —} пенетрантность альвеолярных макрофагов. подтверждено SI Приложение , Рис. S1 A , Левое ) или макрофаги ( CX3CR1 — Bmal1 ^{— / —} , SI Приложение , Рис.S1 A , Правый ) (Рис.1 A и B ). Обе линии мышей показали поразительную защиту от бактериемии (положительный посев крови) через 48 часов после пневмококковой инфекции, но мыши LysM-Bmal1 ^{— / —} также показали снижение бактериальной нагрузки в легких, и наблюдалась тенденция к снижению бактериемии. через 24 ч после инокуляции ( SI Приложение , рис. S1 B ). Не было разницы в общей легочной иммунной клеточности (рис.1 C и SI Приложение , рис. S1 C и D ), ни значительных различий в концентрациях провоспалительных цитокинов периферической крови через 12 и 48 часов после инфицирования ( SI Приложение , рис. S1 E ) . Взятые вместе, эти данные предполагают, что антибактериальная эффективность каждой иммунной клетки выше, тем самым предотвращая распространение инфекции в кровоток с аналогичным количеством эффекторных иммунных клеток в легких.

Удаление BMAL1 в макрофагах защищает от пневмококковой инфекции. ( A ) LysM-Bmal1 ^{— / —} и ( B ) CX3CR1-Bmal1 ^{— / —} мышей (нокаут [KO]) и контрольные однопометные животные (WT) инфицированы флоксами. S. pneumoniae в ZT12. Бактериальная нагрузка в легких и периферической крови в возрасте 48 лет была определена количественно ( n = от 8 до 12, тест Манна-Уитни U * P <0,05). ( C ) Иммунные клетки выделяли из легочной ткани в нейтрофилах A , альвеолярных макрофагах (AM) и интерстициальных макрофагах (IM).( D ) Потеря веса через 48 часов (тест Манна – Уитни U * P <0,05). ( E ) Типичная гистология легких с окрашиванием H&E. (Шкала 50 мкм.) SPN, Streptococcus pneumoniae . ( F ) Цитокиновый анализ легочной ткани из A выполняли с использованием панели воспалительных генов NanoString (см. Также приложение SI , фиг. S1 F ). Каждый из 248 генов помечен, а те, которые статистически различаются по генотипу, отмечены красным цветом с сокращением генов.( G ) Мультиплексный цитокиновый анализ ткани из A ( n = 8, t тест, точное значение P отмечено, и * P ≤ 0,05).

Чтобы проверить идею о том, что потеря BMAL1 в макрофагах обеспечивает системную защиту от пневмонии, мы также измерили потерю веса, меру общесистемного воздействия сепсиса (рис. 1 D ). Мыши, лишенные макрофагов BMAL1, показали заметно меньшую потерю веса, чем контрольные однопометники. Гистологическое исследование пораженных легких показало аналогичный инфильтрат иммунных клеток у обоих генотипов в соответствии с подсчетом иммунных клеток с помощью проточной цитометрии (рис.1 E ). Измерение NanoString экспрессии гена медиатора воспаления показало снижение провоспалительных цитокинов и повышенную экспрессию факторов роста у животных, лишенных макрофага BMAL1, что указывает на состояние прорезолюции по сравнению с контролем из одного помета (Рис. 1 F и SI Приложение , Рис. S1 F ). Предлагаемое снижение экспрессии медиатора воспаления в легких было дополнительно протестировано с использованием набора шариков для измерения концентрации белка в восстановленной ткани легких.Наблюдалась общая тенденция к более низким концентрациям как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов, с CCL2, хемокином моноцитов, и IL10, важным противовоспалительным цитокином, оба показывали значительное снижение (рис. 1 G ).

Ранее мы идентифицировали орфанный ядерный рецептор REVERBα как обязательный медиатор многих воспалительных эффектов, возникающих в результате потери BMAL1 в макрофагах (3). Соответственно, мы протестировали миеломоноцитарное разрушение гена Reverbα, используя описанный штамм DBD ^m , скрещенный с LysM-cre (23) ( SI Приложение , рис.S1 G ). Удивительно, но мы не обнаружили фенотипа с точки зрения бактериального исхода в легких или в крови. Кроме того, мы подвергали животных дикого типа (WT) постоянному свету, который ослабляет циркадные колебания (24, 25). Это также не повлияло на исходы пневмококковой инфекции ( SI Приложение , рис. S1 H ).

Чтобы проверить внутреннюю антибактериальную активность макрофагов, изолированные макрофаги инкубировали с легко проглатываемым бактериальным патогеном, pHrodo-трансгенным Staphylococcus aureus (26).Из-за свойств, присущих красителю pHrodo, проглоченные бактерии флуоресцируют, когда фагосома сливается с кислым лизосомным компартментом (27). Наблюдалось значительное увеличение образования фаголизосом на макрофаг в ответ на делецию Bmal1 , как при тестировании in vivo посредством внутрибрюшинной (ip) инъекции, так и ex vivo, в культуре (фиг.2 A и B ). ). Используя визуализацию живых клеток, кинетика ответа ясна. Мы можем видеть изолированные макрофаги, отвечающие на бактерии фагоцитозом, и наблюдали больший фагоцитоз во все моменты времени, но со значительной разницей, проявляющейся даже через 2 часа после посева.(Рис.2 C — E ) (28). Чтобы исследовать возможную роль секретируемых факторов в увеличении фагоцитоза, мы протестировали влияние кондиционированной среды из макрофагов, не содержащих BMAL1, но это не выявило никакого эффекта, что указывает на клеточно-автономный механизм действия BMAL1 ( SI Приложение , рис. S2 А ). Влияние увеличения бактериального поглощения легко увидеть на флуоресцентной визуализации, где увеличенные макрофаги, нагруженные флуоресцентными бактериями, видны в отсутствие BMAL1 (рис.2 D ).

BMAL1 улучшает фагоцитоз макрофагов. ( A ) LysM-Bmal1 ^{— / —} мышей и флоксированные контрольные мыши были инфицированы i.p. с S. aureus pHrodo green (SAPG). Клетки перитонеального экссудата отбирали через 45 мин и подвергали FACS. MFI был определен количественно (WT n = 5, LysM-Bmal1 ^{— / —} n = 4). * P <0,05; Тест Манна – Уитни U .( B ) Анализ фагоцитоза ex vivo. Перитонеальные макрофаги инкубировали с SAPG в течение 4 ч перед анализом FACS (стратегия гейтирования см. Приложение SI , рис. S1 D ). ( n = 3 мыши) (тест Манна – Уитни U * P ≤ 0,05). Также показаны клетки, инкубированные с SAPG при 4 ° C для ингибирования ферментативной функции макрофагов. ( C — E ) Ex vivo микроскопические анализы фагоцитоза живых клеток с репрезентативным комбинированным светлопольным и флуоресцентным изображениями.Перитонеальные макрофаги были извлечены из LysM-Bmal1 ^{— / —} мышей и контрольных мышей, обработанных флоксами, и засеяны для ( C и D ) 2 ч (WT, n = 48) позиций, LysM -Bmal1 ^{— / —} , n = 57 положений, показаны количественная оценка и репрезентативная флуоресцентная микроскопия. (Шкала, 25 мкм.) ( E ) Через 24 часа (WT n = 25 позиций, LysM-Bmal1 ^{— / —} n = 30 позиций).SAPG добавляли к культурам и измеряли увеличение MFI (среднее значение и SEM, построенные с повторными измерениями ANOVA *** P <0,0001). Репрезентативный график FACS см. В приложении SI , рис. S2 D . ( F ) Анализ фагоцитоза с помощью микроскопии живых клеток альвеолярных макрофагов. ( n = 10 позиций). ( G ) Анализ фагоцитоза нейтрофилов ex vivo. Нейтрофилы костного мозга из LysM-Bmal1 ^{— / —} высевали in vitro и подвергали тому же протоколу фагоцитоза, что и B .Через 4 часа эффект генотипа отсутствовал ( P = 0,2, критерий Манна – Уитни U ). ( H ) Ex vivo Анализ фагоцитоза S. pneumoniae . Перитонеальные макрофаги инкубировали с S. pneumoniae , D39. Через 4 часа после заражения оценивали жизнеспособные внутриклеточные бактерии ( n = 8, тест Манна-Уитни U * P ≤ 0,05). ( I ) Перитонеальные макрофаги мышей C57BL / 6 подвергали анализу на фагоцитоз живых клеток с использованием меченого S.aureus в точках ZT0 и ZT12. ( n = от 36 до 38 лунок за время суток) (тест Манна – Уитни U *** P <0,0001).

Мы вернулись к изучению альвеолярных макрофагов, очищенных из легких и проанализированных ex vivo с использованием оптимизированных протоколов, описанных выше (рис. 2 F ). Опять же, повышенное потребление бактерий наблюдалось в отсутствие BMAL1, что указывает на генерализованный фенотип макрофагов. Поскольку в некоторых из наших исследований использовался драйвер cre LysM-, который также нацелен на нейтрофилы, мы очистили нейтрофилы из костного мозга и протестировали их in vitro, используя тот же самый pHrodo-меченный S.aureus (рис. 2 G ). Хотя наблюдалась тенденция к увеличению фагоцитоза в отсутствие BMAL1, это не было значительным, и величина эффекта была небольшой. Следовательно, основным фактором изменения бактериального ответа при делеции BMAL1 является популяция макрофагов. Поскольку в анализе in vitro использовался помеченный S. aureus , а не S. pneumoniae , мы также протестировали фагоцитоз S. pneumoniae в изолированных макрофагах in vitro с использованием анализа защиты от гентамицина, как и для S.aureus , мы обнаружили, что это было повышено в отсутствие BMAL1, что указывает на более общее антибактериальное свойство модифицированных макрофагов (рис. 2 H ), приводящее к усилению фагоцитоза. Поскольку эти исследования выявили столь поразительное влияние BMAL1 на макрофаги, мы проверили влияние циркадной фазы на фагоцитарный фенотип макрофагов, поскольку в предыдущих отчетах предполагались различия, зависящие от циркадной фазы. Здесь мы действительно увидели, что фагоцитоз был значительно больше во время zeitgeber time (ZT) 12 по сравнению с ZT0 (рис.2 I ).

Мы не наблюдали воздействия ни разрушения ДНК-связывающего домена REVERBα, ни полной делеции REVERBα на фагоцитоз изолированных макрофагов ( SI Приложение , рис. S2 B ), что подтверждает отсутствие фенотипа пневмококковой инфекции in vivo. Дальнейший анализ с использованием лиганда REVERB GSK4112, который нацелен на оба паралога REVERB, не оказал влияния на фагоцитоз ( SI Приложение , рис. S2 C ).

Экспрессия BMAL1 управляет определенным фенотипом макрофагов.

При непредвзятом анализе экспрессии генов 84 медиаторов фагоцитоза не было обнаружено различий в нестимулированных условиях между контролем и перитонеальными макрофагами без BMAL1, и оба генотипа показали схожее значительное изменение экспрессии генов при активации (Рис. 3 A ). Это предполагает, что функциональное различие между генотипами лежит на уровне посттрансляционной модификации аппарата фагоцитоза, а не на уровне экспрессии фагоцитарных генов.Известно, что фосфорилирование играет важную роль в циркадном контроле физиологии (29). Поэтому мы проанализировали фосфопротеомные изменения между нулевым BMAL1 и контрольными макрофагами и измерили их до и сразу после бактериального воздействия. Здесь мы увидели поразительную разницу между генотипами в условиях покоя, с заметным снижением обнаруженных фосфозитов в макрофагах, нулевых BMAL1 (рис.3 B ), но незначительные различия остаются после контакта с бактериями (рис.3 С ). Это дополнительно проиллюстрировано анализом внутри генотипа, где наибольшая разница после стимуляции наблюдается в контрольных клетках по сравнению с макрофагами без BMAL1, где активация макрофагов до стимуляции означает меньшее количество изменений фосфозитов после бактериальной стимуляции ( SI Приложение , рис. S3 A ). Сетевой анализ ( SI Приложение , Рис. S3 B ) подчеркивает основные пути, участвующие в подвижности клеток и фагоцитозе, включая актиновый цитоскелет, который дифференцированно фосфорилирован и, таким образом, активирован между генотипами ( SI Приложение , Рис. .S3 C ).

BMAL1 в макрофагах предварительно активирует клетки. ( A ) Массив генов фагоцитоза в перитонеальных макрофагах с использованием технологии NanoString. Перитонеальные макрофаги очищали от LysM-Bmal1 ^{— / —} и контрольных мышей из однопометного помета и культивировали in vitro в течение 24 часов, а затем добавляли 100 мкг / мл S. aureus или контрольную среду на 1 час. . РНК очищали и анализировали с помощью NanoString, используя панель фагоцитоза ( SI, приложение , таблица S1).Показан график анализа главных компонентов (PCA), сравнивающий стимулированные и контрольные клетки обоих из двух генотипов, с LysM-Bmal1 ^{— / —} (красный) и контрольными контрольными однопометными клетками (синий). Каждая точка представляет собой отдельную мышь. ( B и C ) Перитонеальные макрофаги из LysM-Bmal ^{— / —} и флоксированные контроли из однопометников, собранные на ZT2, культивировали в течение 24 ч, а затем обрабатывали 100 мкг / мл S.aureus в течение 30 мин (стимулированный) или контроль носителя (нестимулированный). Клетки собирали и очищали фосфопептиды. На графиках вулканов значимые изменения в выявленных сайтах фосфорилирования показаны красным цветом. Отрицательные значения оси x указывают на более низкие значения в клетках BMAL1 ^{— / —} (идентифицированные дисперсионным анализом с апостериорным тестом; n = 3). ( D ) RNA-Seq в нестимулированных перитонеальных макрофагах. График средней величины (MA), показывающий 454 гена с коэффициентом ложного обнаружения (FDR) <0.01, красным. Cpm, на миллион. ( E ) Основные термины болезней и функций IPA для значимых генов DE в D . ( F ) Обогащение генов RNA-Seq DE по отношению к сайтам связывания BMAL1 для различных геномных расстояний от центра пиков связывания BMAL1. ( G ) 10 основных мотивов, обнаруженных с использованием пиков BMAL1, перекрывающихся с генами DE на расстоянии ± 100 т.п.н. ( H ) Основные термины о заболеваниях и функциях IPA для 148 прямых генов-мишеней BMAL1.

Чтобы определить, как BMAL1 влияет на подвижность клеток и фагоцитоз, мы использовали объективный подход, очистили перитонеальные макрофаги и провели анализ РНК-Seq, сравнивая два генотипа в условиях покоя (рис. 3 D ). Основными терминами онтологии генов, идентифицированными при анализе дифференциальной экспрессии генов, были движение клеток и миграция клеток (рис. 3 E ). Хотя фагоцитоз макрофагов был представлен как важный термин, он был гораздо менее значимым, предполагая, что подвижность макрофагов может быть доминирующим аспектом фенотипа, а не механикой поглощения бактериями, что объясняет неспособность исходного анализа NanoString идентифицировать различия в экспрессии генов фагоцитоза. в отсутствие BMAL1.Используя анализ пути изобретательности (IPA) (Qiagen), мы идентифицировали дифференциально регулируемые гены в пути движения клеток (фиг. 3 D и E и набор данных S2). Затем мы выполнили интегративный анализ дифференциально экспрессируемых генов из RNA-Seq и сайтов связывания, идентифицированных в ранее опубликованном наборе данных иммунопреципитации хроматина (ChIP) -Seq перитонеального макрофага BMAL1 (30). Здесь мы удлиняем сайты связывания BMAL1 в обоих направлениях и извлекаем ближайшие кодирующие гены.Взяв эти гены, чьи сайты начала транскрипции (TSS) перекрываются с сайтами связывания BMAL1 для данного геномного расстояния, мы вычисляем статистическое обогащение нашего дифференциально регулируемого набора генов (тех, которые изменяются в макрофагах с нулевым BMAL1). Таким образом, мы идентифицируем сильное обогащение наших DE-генов до 100 т.п.н. от сайтов связывания BMAL1, после чего статистическая значимость снижается (рис. 3 F ). Поэтому мы используем отсечку на расстоянии 100 т.п.н. по обе стороны от сайтов связывания BMAL1, что дает нам субнабор из 148 генов из нашего набора генов DE.Анализ мотивов соответствующих пиков BMAL1 дает множественные мотивы E-бокса в качестве главных совпадений, как можно было бы предсказать для сайтов связывания BMAL1 (фиг. 3 G ). IPA-анализ этих 148 генов, обнаруженных с помощью этого интегративного анализа с точки зрения заболеваний и функций, дает сильные термины, связанные с подвижностью и фагоцитозом (рис. 3 H и набор данных S3).

Поскольку актиновый цитоскелет стал сильной мишенью для BMAL1 в макрофагах, морфология клеток была изучена более тщательно.Наблюдалась резкая разница во внешнем виде с потерей кортикального актина и заметным округлением клеток, наблюдаемым в макрофагах с нулевым BMAL1 (фиг. 4 A и B и фильмы S1 и S2). Это подразумевает более подвижный фенотип, и действительно, клетки BMAL1 ^{— / —} перемещались на значительно большее расстояние при отслеживании в реальном времени (рис. 4 C и D и SI Приложение , рис. S4 A — D ), без направленности. Однако мы не увидели устойчивой разницы в соотношении G / F-актин между генотипами (рис.4 E ). Макрофаги демонстрируют скоординированную миграцию по градиентам хемокинов. Чтобы определить, трансформируется ли повышенная подвижность клеток в большую скорость вдоль градиента хемокина CCL2, мы использовали анализ хемотаксиса камеры Бойдена (фиг. 4 F и SI Приложение , фиг. S4 E ). Это не показало никаких различий в генотипах, идентифицируя довольно специфическое изменение фенотипа макрофагов, которое было ограничено подвижностью и не влияло на миграционную реакцию на сигнал хемокина.

BMAL1 изменяет морфологию и подвижность макрофагов. ( A и B ) Перитонеальные макрофаги из LysM-Bmal1 ^{— / —} и контрольные группы однопометных пометов с флоксами. Получение изображений живых клеток с помощью конфокальной микроскопии сверхвысокого разрешения с использованием детектора Airyscan, показывающего F-актин. (Масштабная шкала, 10 мкм.) ( C и D ) Макрофаги также отслеживали посредством спонтанной миграции в течение 4 часов с использованием кинетического цитометра Livecyte (фазовый фокус).Пройденное расстояние и направление представлены на графиках роз. Средняя длина шага WT 3,81 мкм и KO 5,04 мкм; медианная длина шага WT 2,24 мкм и KO 3,61 мкм; непарный тест t , значение P <0,0001 (номер клетки WT n = 683, KO n = 870 комбинаций клеток из 12 лунок на генотип). ( E ) Макрофаги (WT и KO) культивировали в течение 72 часов после восстановления от животных перед лизисом и анализом глобулярного и нитчатого актина. Различные молекулярные формы были количественно определены с помощью иммуноблоттинга и нанесены на график.Эффекта генотипа не было. ( F ) Анализ миграции через лунки. Перитонеальные макрофаги культивировали in vitro в количестве 1 × 10 ⁵ клеток на 24-луночный планшет во вставке Transwell. Миграцию через мембрану к CCL2 при 500 нг / мкл количественно оценивали с помощью окрашивания кристаллическим фиолетовым через 4 часа (тест Манна-Уитни U ; NS P > 0,05).

Путь передачи сигналов RhoA является основным регулятором актинового цитоскелета и активируется в макрофагах опсонизированными комплементом бактериями через рецептор комплемента 3.Поэтому мы провели эксперименты по фагоцитозу с сывороткой и проанализировали активность RhoA. Действительно, потеря BMAL1 заметно увеличивает активацию RhoA в условиях покоя (фиг. 5 A ). Для дальнейшего изучения ремоделирования актинового цитоскелета мы проанализировали фосфокофилин, главный регулятор деполимеризации актина, и определили, что бактериальная активация макрофагов снижает фосфокофилин в контрольных клетках, но в макрофагах, не содержащих BMAL1, уровень фосфокофилина уже низкий (рис.5 В ). В целом наши данные предполагают, что BMAL1 поддерживает макрофаги в состоянии покоя. Когда BMAL1 удаляется, мы видим изменение фенотипа макрофагов с активацией RhoA, ремоделированным цитоскелетом, повышенной подвижностью клеток и повышенным фагоцитозом. Чтобы проверить идею о том, что базальной индукции в RhoA достаточно для примирования BMAL1-нулевых макрофагов для усиления бактериального фагоцитоза, мы использовали ингибитор RhoA (CT04) (31). В этом исследовании ингибитор титровали в тесте на фагоцитоз и измеряли воздействие.Опять же, мы наблюдали базальное увеличение фагоцитоза в макрофагах с нулевым BMAL1, но теперь мы видим, что он снижается до уровня активности дикого типа в макрофагах с нулевым BMAL1 в ответ на ингибирование низких доз RhoA при недостаточной концентрации. воздействовать на клетки дикого типа (фиг. 5 C ). При более высоких концентрациях оба генотипа макрофагов показывают снижение бактериального поглощения без различий в генотипах.

Делеция Bmal1 увеличивает активацию RhoA, а ингибирование RhoA спасает фенотип фагоцитоза.(A) Перитонеальные макрофаги из LysM-Bmal1 ^{— / —} (KO) и контрольные образцы из однопометного помета (WT) культивировали в контрольных условиях в течение 24 часов после сбора урожая. Клетки лизировали и анализировали на BMAL1, GAPDH, общий RhoA и активный RhoA. После нормализации до GAPDH определяли количество активного и общего RhoA. * P <0,05. ( B ) Макрофаги (WT и KO) были активированы убитыми нагреванием S. aureus в течение 30 минут перед тем, как белковый лизат анализировали на фосфо и общий кофилин с BMAL1 и ламином в качестве контроля; * P <0.05 по тесту Манна – Уитни U . ( C ) Макрофаги (WT и KO) культивировали в течение 24 часов после выделения из животных, а затем подвергали анализу фагоцитоза живых клеток с помеченным S. aureus . Клетки инкубировали с ингибитором CT004 RhoA в указанных концентрациях за 1 час до добавления бактерий ( n = 4 на дозу). Показаны среднее и стандартное отклонение; * P <0,05 по критерию Манна – Уитни U . ( D ) Макрофаги (WT и KO) культивировали в течение 24 часов после выделения из животных в контрольных условиях перед лизисом и анализом экспрессии WAVE2 с помощью иммуноблоттинга; * P <0.05 по тесту Манна – Уитни U . ( E ) Схематическая диаграмма, показывающая, как 164 гена, участвующие в термине перемещения клеток (фиг. 3 E и набор данных S2), соединяются с RhoA в IPA и генами с сайтами начала транскрипции в пределах 100 т.п.н. от пиков BMAL1.

Мы исследовали нижестоящие медиаторы активированных малых ГТФаз в целевых макрофагах и, основываясь на анализе фосфопротеинов ( SI Приложение , рис. S3 C ), обнаружили заметное увеличение базальной экспрессии WAVE2 (рис.5 D ), существенное звено между GTPases и Arp2 / 3 регуляцией ветвления актина и полимеризацией, обеспечивая дополнительные доказательства ремоделированного аппарата контроля актина. Выявив сильный сигнал для дифференциальной активности в путях, влияющих на актиновый цитоскелет и Rho GTPases в анализе фосфопротеома ( SI Приложение , рис. S3 C ), и обнаружив, что движение клеток было идентифицировано как наиболее значимые «заболевания и функции» ”В транскриптоме (рис.3 E ), мы затем попытались определить регуляторные связи между BMAL1 и RhoA. Термин IPA «движение клеток» был доставлен 164 генами, которые, как было установлено, регулируются по-разному. Из этих генов 29 генов имеют функциональные связи с RhoA в IPA ( SI Приложение , рис. S5), причем 8 из этих генов также расположены в пределах 100 т.п.н. пиков BMAL1 с высокой степенью достоверности (30) (рис. 5 E и SI Приложение , рис. S5).

Обсуждение

Несмотря на недавние достижения в понимании суточного контроля иммунной системы, относительно мало известно о том, как антибактериальные реакции зависят от временного стробирования.Теперь мы демонстрируем неожиданное усиление функции макрофагов после делеции BMAL1, что приводит к значительному снижению пневмококковой инвазии. Эта защита, по-видимому, обусловлена ​​повышенной подвижностью макрофагов и фагоцитарной функцией. Эффект был ограничен макрофагами и не наблюдался в нейтрофилах. Дальнейший анализ выявил изменения в активности RhoA и кофилина, возникающие в результате потери BMAL1, и серьезную реорганизацию макрофагального цитоскелетного актина. Мы использовали ингибитор RhoA для дальнейшего исследования функции и обнаружили, что очень низкие концентрации, недостаточные для воздействия на клетки дикого типа, были достаточны для снижения скорости фагоцитоза до уровня, наблюдаемого в клетках дикого типа, что подтверждает важную роль активации RhoA в клетках дикого типа. фенотип фагоцитарного увеличения функции.

Многие типы иммунных клеток обладают внутренней активностью циркадных часов, что приводит к изменению реакции во времени (1). К иммунным ответам, находящимся под циркадным контролем, относятся острое воспаление, летальность в ответ на эндотоксический шок, аллергические реакции, выброс цитокинов и фагоцитоз макрофагов (2, 3, 32–34). Восприимчивость мышей к инфекции Listeria monocytogenes , S. typhimurium и S. pneumoniae — все они демонстрируют суточный ритм, что указывает на фундаментальную роль циркадных часов в защите бактерий (5, 7, 18).

Был предложен ряд типов клеток и механизмов, обеспечивающих временный контроль воспаления и антибактериального ответа, включая барьерный эпителий и клетки врожденного иммунного ответа, включая нейтрофилы, моноциты Ly6C ^hi и резидентные тканевые макрофаги (3, 5, 7). Предыдущие попытки проанализировать циркадный контроль фагоцитоза привели к противоречивым результатам. Oliva-Ramírez et al. наблюдали небольшие размеры эффекта и слабую циркадную ритмичность в изолированных клетках, и все циркадные сигналы терялись в свежеизолированных макрофагах, восстановленных в разное время (20).Напротив, Гейгер и др. обнаружили только различия ex vivo в фагоцитозе, но не обнаружили никаких эффектов in vivo (21). Следовательно, роль часов в фагоцитозе остается неопределенной, и механистические связи остаются неопределенными. Поскольку мы ранее наблюдали поразительную временную регуляцию пневмококковой пневмонии, которая не объяснялась делецией Bmal1 в клубной клетке, мы вернулись к этой модели, чтобы определить, как миелоидный хронометраж влияет на антибактериальную функцию макрофагов. В наших исследованиях макрофагов мы использовали две линии драйверов cre: LysM и CX3CR1.Хотя драйвер CX3CR1 имеет главное преимущество в том, что он не нацелен на нейтрофилы, сообщалось, что он нацелен на делецию генов в других типах миелоидных клеток, включая тучные клетки, дендритные клетки и клетки естественных киллеров (NK) (35). Однако эти типы клеток не играют заметной роли в острых бактериальных инфекциях.

Поразительное наблюдение, что потеря гена центральных часов Bmal1 привела к серьезному защитному эффекту против бактериемии при пневмококковой пневмонии, было неожиданным, поскольку большинство нарушений циркадного ритма ухудшают физическую форму.Дальнейший анализ показал, что эффект был связан с повышенной подвижностью и фагоцитозом, когда клетки поглощали больше бактерий. Эффект был ограничен макрофагами и не наблюдался у нейтрофилов, несмотря на сходные молекулярные механизмы действия. Однако у макрофагов есть сильные эндогенные часы, связанные с воспалительными сигнальными каскадами, а в нейтрофилах хронометраж частично определяется сосудистой сетью через действия хемокинов, а также частично действием BMAL1, управляющим программой экспрессии генов, которая влияет на клеточное старение. миграция тканей и состояние воспалительной активации (9, 13).Важно отметить, что наши данные, раскрывающие реакцию на пневмококковую инфекцию, удивительны, поскольку ранее проведенная работа показала, что потеря BMAL1 в миелоидном клоне приводит к усилению воспалительных реакций на бактериальные миметики, такие как липополисахарид (3). Кроме того, предыдущие исследования показали повышенный риск смерти от сепсиса в ответ на бактериальную инфекцию, вызванную листериями, при внутрибрюшинном введении. инъекции (7), вероятно, в результате повышенной продукции цитокинов, вызывающей фенотип септического шока.Ключевым отличием здесь является введение сублетального инфекционного инокулята в легкое, что позволяет выработать эффективный иммунный ответ, и в этих обстоятельствах фенотип фагоцитоза макрофагов с усилением функции дает значительное преимущество хозяину. Измерения цитокинов через 48 часов в нашей модели соответствуют уменьшенной бактериальной нагрузке и отмечают переход к разрешению инфекции.

Открытие BMAL1-зависимой активации RhoA и ремоделирования актина цитоскелета напоминает изменения RhoA, наблюдаемые в эпителиальных / фибробластных клетках после циркадных манипуляций, с влиянием на кинетику заживления ран (31).О подобной перекрестной связи между динамикой актина и циркадным механизмом сообщили Schibler и его коллеги, предполагая, что сигнальный путь от сывороточного фактора ответа через G / F-актин влияет на циркадную фазу, а реципрокная передача сигналов вносит вклад в выбор времени митоза (28). В нашем анализе мы обнаружили широко распространенное перепрограммирование подвижности клеток и экспрессии генов цитоскелета в ответ на делецию BMAL1 макрофагами. Это, вместе с отсутствием фенотипа направленной миграции хемокинов, предполагает, что основным механизмом фагоцитарного фенотипа является усиление подвижности после потери организованного кортикального актина в макрофагах.

Вместе взятые, мы сообщаем об усилении функции макрофагов после делеции основного тактового белка BMAL1 и раскрываем механизм, в котором BMAL1 действует как репрессор иммунной системы, действуя как «тормоз», регулируя величину фагоцитозных ответов. после заражения. Это не наблюдалось при манипуляциях REVERBα и не могло быть воспроизведено физиологическими циркадными манипуляциями с использованием изменений внешнего освещения, хотя это воздействие окружающей среды могло не повлиять на циркадные часы макрофагов в достаточной степени, чтобы обнаружить эффект.В отсутствие экспрессии BMAL1 REVERBα значительно снижается, и клетки лишены циркадной ритмичности, но, напротив, в отсутствие REVERBα экспрессия BMAL1 высока, и клетки остаются циркадными ритмичными. Хотя ранее мы показали, что преувеличенные цитокиновые ответы, наблюдаемые в эпителии дыхательных путей, лишенном BMAL1, фенокопируются нарушением REVERBα, здесь мы документируем BMAL1-зависимый и REVERBα-независимый путь, регулирующий миграцию макрофагов и фагоцитоз. Таким образом, эти два часовых белка выполняют отдельные, но взаимосвязанные функции в выработке воспалительного ответа, регулируя высвобождение цитокинов и локальную тканевую нейтрофилию (REVERB-зависимую) и поведение фагоцитоза макрофагов (BMAL1-зависимую).Ранее мы показали, что острые TLR-4-опосредованные цитокиновые ответы на LPS опосредуются быстрой деградацией репрессорного белка REVERBα [14]. Следствием наших текущих исследований, которые еще предстоит проверить, является то, что после инфекции усиленный фагоцитоз также может быть опосредован аналогичной быстрой деградацией белка BMAL1 в клетках макрофагов. Здесь мы не можем исключить, что потеря как REVERBα, так и REVERBβ может реплицировать потерю BMAL1, но в равной степени эффект BMAL1 может быть опосредован не-REVERB путем, который основан на прямом действии BMAL1 на подвижность и экспрессию генов цитоскелета.Действительно, связывание BMAL1 было обнаружено вблизи ключевых эффекторных генов подвижности, что поддерживает прямую регуляцию BMAL1.

Схема, включающая реорганизацию актина цитоскелета, была связана с циркадными часами раньше в фибробластах, но теперь мы обнаруживаем, что это дает BMAL1 контроль подвижности макрофагов и фагоцитозу. Трансляционные последствия очевидны: целевые вмешательства для воспроизведения увеличения функции макрофагов являются привлекательными подходами для лечения распространенных инфекционных заболеваний.

Материалы и методы

Животные.

Колонии LysM-Bmal1 ^{— / —} , LysM-Rev-Erbα-DBD ^м и CX3CR1-Bmal1 — / — мыши. Фонд биологических услуг Манчестерского университета (BSF). Когда использовали мышей только WT, C57BL / 6 приобретали у Envigo. Все генетически модифицированные мыши были созданы на фоне C57BL / 6 и содержались в циклах 12:12 свет / темнота (L: D) с кормом и водой, подаваемыми ad libitum.Все протоколы были одобрены Управлением по надзору за благополучием и этикой животных Манчестерского университета, а также строго соблюдались директивы Министерства внутренних дел Великобритании по Закону о животных (научные процедуры) 1986 года. У условно нацеленных кре-позитивных мышей были сопоставлены пол и возраст с контрольными животными, подвергнутыми флоксованию / флоксированию; самок в возрасте от 10 до 14 недель использовали для экспериментов in vivo, а клетки перитонеального экссудата (PECs) ex vivo собирали у самцов мышей. Генотипирование проводили всем экспериментальным животным.

Мышей инфицировали в ZT12 S. pneumoniae (серотип 2, штамм D39) (Национальная коллекция типовых культур [NCTC] 7466), интраназально 1 × 10 ⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ) на мышь в 20 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) под изофлурановой анестезией. Животных умерщвляли через 24 или 48 часов. Кровь собирали из бедренной артерии (на гепарин 1:20). Использовали два метода подготовки легочной ткани: переваривание легочной ткани и гомогенат легкого.Переваривание ткани легкого получали путем переваривания измельченной ткани в растворе 0,154 мг / мл коллагеназы I и II (Liberase TM, Roche 05401127001) и 50 мкг / мл ДНКазы I (Roche 11284932001). Через 30 мин при 37 ° C реакцию останавливали этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и гидролизат пропускали через фильтр с размером пор 70 мкМ. Гомогенат готовили в пробирках Rhino вместе с шестью шарикоподшипниками 3,2 мм. Пробирки помещали в блендер Storm Bullet на 5 мин при настройке 8. Цельную кровь и гомогенат легких высевали на чашки с кровяным агаром Columbia в серийном разведении в течение ночи при 37 ° C и подсчитывали КОЕ на следующий день.

Первичная культура клеток.

Клетки собирали у мышей с помощью перитонеального лаважа. PECS выделяли, ресуспендировали в полной культуральной среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) и высевали в количестве 3 × 10 ⁵ клеток / см ² . Клетки промывали средой и затем использовали в экспериментах. Что касается нейтрофилов, собирали костный мозг с извлеченными нейтрофилами с использованием набора для обогащения нейтрофилов (STEMCELL Technologies). Альвеолярные макрофаги собирали путем закапывания 1 мл PBS через трахею в легкие, и этот процесс повторяли три раза.

Анализ фагоцитоза.

В этих исследованиях использовались различные типы анализа фагоцитоза: in vivo, ex vivo, фиксированная точка времени, микроскопия живых клеток в реальном времени и считыватель планшетов.

Анализ фагоцитоза in vivo.

Мышам вводили внутрибрюшинно. с 10 мкг (в 200 мкл) ослабленного S. aureus , экспрессирующего pHrodo green (SAPG). PEC собирали и дважды промывали в PBS и ресуспендировали в буфере FACS (PBS, 2% [бычий сывороточный альбумин] 0,1% азид натрия). Образцы с избыточным загрязнением крови исключались из анализа.Проточную цитометрию выполняли сразу на проточном цитометре BD FACS CANTO. Дебрис извлекали и измеряли среднее геометрическое в канале флуоресценции флуоресцеина изотиоцианата (FITC).

Проточная цитометрия.

Одноклеточная суспензия была создана из легочного гидролизата, чтобы дать возможность охарактеризовать легочный инфильтрат во время пневмококковой инфекции. Впервые был применен маркер «живой / мертвый» (LifeTechnologies L10119; 1: 1000) в PBS. Антитела и блокатор готовили в буфере FACS (PBS, 2% BSA и 0.1% азид натрия): рецепторы Fc были заблокированы (1: 100; анти-CD16 / 32, eBioscience 14-0161). Антитела инкубировали 25 мин при 4 ° C. Мы использовали CD11b-PerCPCy5.5 (1: 200; клон M1 / ​​70, 45-0112), CD11c-APC (1: 400; клон N418, 17-0114), Ly6G-FITC (1: 100; клон RB6-8C5). , 11-5931) и F4 / 80-PE-Cy7 (1: 200; клон BM8, 25-4801) (все eBioscience). После отмывки клетки ресуспендировали в 50 мкл 1% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре (RT). Клетки промывали, ресуспендировали в буфере FACS и анализ выполняли на проточном цитометре BD FACS CANTO.Нейтрофилы были идентифицированы как f4 / 80 ^— CD11b ⁺ Ly6G ⁺ . Альвеолярные макрофаги были идентифицированы как F4 / 80 ⁺ CD11c ⁺ CD11b ^lo . Интерстициальные макрофаги были идентифицированы как F4 / 80 ⁺ CD11c ^— CD11b ^hi .

Анализ фагоцитоза с фиксированной временной точкой.

PECS высевали из расчета 5 × 10 ⁵ клеток на лунку в 24-луночный планшет. После отмывки клетки инкубировали в свежей полной RPMI с 0.1 мг / мл SAPG . Клетки-мишени и флоксированные контроли инкубировали при 37 ° C и в отдельном планшете при 4 ° C. Через 4 часа фагоцитоз останавливали промывкой ледяным PBS и клетки отделяли 200 мкл 1 × трипсина EDTA (Sigma) при 37 ° C в течение 15 минут, что подтверждается микроскопией. Клетки дважды промывали и ресуспендировали в буфере FACS. Проточную цитометрию выполняли сразу на проточном цитометре BD FACS CANTO, и среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) количественно определяли в канале FITC.

Микроскопия живых клеток в реальном времени.

PECS высевали из расчета 5 × 10 ⁵ клеток на лунку в 24-луночный планшет. Применяли свежий RPMI (Sigma) с 10% FBS (Life Technologies) и 1% пенициллин / стрептомицин (Sigma). S. aureus pHrodoGreen (SAPG) 0,1 мг / мл добавляли в момент времени 0. Множественные изображения получали на инвертированном микроскопе Eclipse Ti (Nikon), с объективом 20x и каналом Nikon с зеленым светодиодом FITC. Изображения были сняты камерой Retiga R6, и использовалось программное обеспечение для обработки изображений NIS Elements AR (Nikon). Посещение точек использовалось, чтобы позволить визуализировать несколько положений в течение одного и того же периода времени, и клетки поддерживали при 37 ° C и 5% CO ₂ .Файлы изображений Nd2 были извлечены в стопки TIFF и обработаны в ImageJ (NIH). Интенсивность флуоресценции в каждой позиции определялась количественно в зеленом канале в каждом поле зрения в каждый момент времени. Затем наносили среднее значение для каждого генотипа в зависимости от времени.

Ex vivo

Перитонеальные макрофаги инфицировали пневмококками, опсонизированными комплементом (из цельной мышиной сыворотки) для усиления прилипания при множественности инфекции (MOI) 10, инкубировали при 4 ° C в течение 1 ч (для максимального прилипания), а затем при 37 ° C в течение 3 часов (для интернализации макрофагами) (36).Культуры промывали 3 раза PBS для удаления неприлипающих бактерий. Затем клетки инкубировали с бензилпенициллином и гентамицином для уничтожения оставшихся внеклеточных бактерий, как описано. Клетки лизировали сапонином и количественно определяли количество живых внутриклеточных бактерий по методу Майлза Мисры (37).

Планшетный ридер для анализа фагоцитоза.

PECS высевали в 96-луночный планшет и инкубировали с 50 мкг SAPG. Флуоресценцию измеряли с помощью мультидетекторного ридера Promega Glow max.Для ингибирования RhoA перед фагоцитозом клетки обрабатывали ингибитором RhoA CT04 (Cytoskeleton Inc.) или контрольным носителем за 2 часа до анализа фагоцитоза с SAPG.

Нано-струнный генный массив.

Перитонеальные макрофаги инкубировали с термообработанными S. aureus (штамм древесины, без протеина А) в течение 1 часа. Клеточную минипреп-систему Promega Reliaprep (TM370) использовали для лизиса клеток и экстракции РНК. Качество РНК оценивали с помощью Agilent RNA TapeStation. Концентрацию РНК определяли количественно с помощью Qubit, и концентрацию образца доводили до 20 нг / мкл в 10 мкл.Затем РНК запускали на NanoString nCounterTM (NanoString Technologies) в сочетании с настраиваемой панелью генов фагоцитоза.

РНК-Seq.

PECS из LysM-Bmal1 ^{— / —} и контрольные потомки ( n = 5) высевали из расчета 5 × 10 ⁵ клеток на лунку в 24-луночный планшет. После промывания перитонеальные макрофаги лизировали и РНК экстрагировали с помощью ReliaPrep RNA cell miniprep (Promega). Качество РНК оценивалось с использованием 4200 Tapestation (Agilent Technologies), и все значения числа целостности РНК (RIN) были> 9.0. Неотмеченные последовательности парных концов из секвенатора Illumina HiSeq4000 были протестированы FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). Адаптеры последовательностей были удалены, и считанные данные были обрезаны по качеству с использованием Trimmomatic_0.36 (38). Считывания были сопоставлены с эталонным геномом мыши (mm10 / GRCm38), а количество на ген было рассчитано с использованием аннотации из GENCODE M21 (www.gencodegenes.org/) с использованием STAR_2.5.3 (39). Нормализация, анализ главных компонентов и дифференциальное выражение были определены с помощью DESeq2_1.24,0 (40).

Для расчета обогащения нашего набора дифференциально экспрессируемых генов (padj <0,01) относительно данных BMAL1 ChIP-Seq мы использовали общедоступные данные макрофагов BMAL1 ChIP-Seq из базы данных Cistrome [Oishi et al. (30), LPS 0 h], и мы извлекли наборы генов, чьи TSS перекрываются с пиками BMAL1 для различных геномных расстояний, то есть от ± 2 kb до ± 1 Mb в семи ячейках от центра пика. Для каждого такого набора генов, соответствующего данному геномному расстоянию, было рассчитано гипергеометрическое значение P для его пересечения с генами RNA-Seq DE с общим числом генов в геноме (мм10) в качестве фона.

Вестерн-блоттинг.

Общий клеточный белок выделяли из клеток с использованием буфера для лизиса (50 мМ Трис, 150 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 0,2% SDS, с добавлением ингибиторов протеаз). Равные количества белка обрабатывали на SDS 4-20% мини-протеине TGX, не содержащем пятен, протеиновом геле TGX (Bio-Rad) и переносили на мембрану PVDF с низкой флуоресценцией (Bio-Rad) с помощью системы переноса Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). . Мембраны блокировали блокирующим буфером Odyssey (Li-Cor) в течение 1 ч при комнатной температуре.Образцы анализировали антителом в течение ночи при 4 ° C (BMAL1-D2L7G, Cell Signaling Technologies 14020). Иммунореактивность визуализировали с помощью системы визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне Odyssey CLx и количественно оценивали флуоресценцию в ImageStudioLite (Li-Cor).

Соотношение G-актин / F-актин.

Экспрессию G- и F-актина определяли с использованием набора для анализа G-actin / F-actin In vivo от Cytoskeleton, использованного в соответствии с инструкциями производителя (BK037). Протокол отделяет нитчатый от глобулярного актина ультрацентрифугированием перед обнаружением с помощью иммуноблоттинга.

Анализ активации RhoA.

Активность RhoA измеряли с использованием набора RhoA Activation Assay Biochem Kit by Cytoskeleton, выполняемого в соответствии с инструкциями производителя (BK036).

Анализ миграции Transwell.

В 24-луночные вкладыши для культуры подвешенных клеток Millicell (Millipore, MCEP24h58, поры 8 мкм) засевали 1 × 10 ⁵ перитонеальных макрофагов, индексные лунки обрабатывали 500 нг / мл CCL2 (R&D Systems) и инкубировали. за 4 ч. Клетки фиксировали в 4% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре.Немигрированные клетки удаляли ватным тампоном. Клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым (5 мг / мл в 2% этаноле) в течение 30 мин при комнатной температуре. Вставки дважды промывали PBS и механически удаляли избыток пятен с верхней стороны мембраны. Мигрировавшие клетки солюбилизировали в 2% SDS в течение ночи при комнатной температуре, и оптическую плотность считывали при 560 нм (планшет-ридер Glomax, Promega).

Миграционная микроскопия.

Количественные фазовые изображения без этикеток были созданы с помощью автоматизированного программного обеспечения Livecyte Acquire и алгоритма птихографической реконструкции.Клетки визуализировали с помощью линзы объектива 20 × каждые 10 мин. Во время визуализации клетки поддерживали в камере для окружающей среды при 37 ° C, 5% CO ₂ и 95% влажности. Отслеживание клеток выполнялось автоматически с помощью программного обеспечения Livecyte Analyze. Метрики миграции отдельных ячеек: скорость ячеек и длина трека были экспортированы из Analyze и нанесены на график.

Заявление о доступности данных.

Данные RNA-Seq, подтверждающие результаты этого исследования, были депонированы в ArrayExpress, https: // www.ebi.ac.uk/arrayexpress/, с регистрационным кодом E-MTAB-8411 (41).

Благодарности

Работа поддержана грантами Совета по исследованиям биотехнологии и биологических наук, присужденными A.S.L. и D.W.R. (BB / L000954 / 1, BB / K003097 / 1) и грант программы Совета медицинских исследований (MRC) (MR / P023576 / 1). D.W.R. и A.S.L. являются исследователями Wellcome, Wellcome Trust (107849 / Z / 15 / Z, 107849 / A / 15 / Z). H.J.D. поддерживается премией Asthma UK Senior Clinical Academic Development Award (AUK-SCAD-2013-229).J.F.B. является врачом-клиницистом MRC (MR / L006499 / 1). Г.Б.К. является научным сотрудником MRC по клиническим исследованиям (MR / N002024 / 1). J.F.B. и H.J.D. также частично поддерживаются Манчестерским центром биомедицинских исследований Национального института медицинских исследований (NIHR). Мы благодарим Энди Хейса, Михала Смигу и Лео Зифа (основные объекты биоинформатики и геномных технологий, Манчестерский университет) за поддержку в отношении анализа NanoString и RNA-Seq; Питу Уокеру (Гистологический центр Манчестерского университета) за поддержку в гистологии; Питеру Марчу и Дэвиду Спиллеру (центр биовизуализации, Манчестерский университет) за поддержку в области визуализации; и мы также признательны персоналу учреждения биологических услуг (BSF) за уход за животными.

Сноски

• Вклад авторов: G.B.K., T.H., L.C.M., D.H.D., H.J.D., J.F.B., A.S.L. и D.W.R. спланированное исследование; G.B.K., P.S.C., T.M.P., M.B., J.B., N.B., B.S. и J.F.B. проведенное исследование; J.E.G., J.F.B., A.S.L. и D.W.R. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; G.B.K., T.M.P., M.I., R.M., J.B., J.F.B. и D.W.R. проанализированные данные; и G.B.K., M.I., D.H.D., HJ.D., J.E.G., J.F.B., A.S.L. и D.W.R. написал газету.

• Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Размещение данных: данные RNA-Seq, которые подтверждают результаты этого исследования, были депонированы в ArrayExpress, https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/ (код доступа E-MTAB-8411).

• Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.12117/-/DCSupplemental.

• Copyright © 2020 Автор (ы). Опубликовано PNAS.

Контролируемая циркадными часами экспрессия генов в совместно культивируемых цианобактериях, образующих мат

ST16C1551 — MaxLinear

MaxLinear Inc.(«MaxLinear») настоящим предоставляет Пользователю этой модели IBIS / BSDL для конкретного продукта MaxLinear неисключительную непередаваемую лицензию на использование этой модели IBIS / BSDL для конкретного продукта MaxLinear на следующих условиях.

Перед использованием этой модели IBIS / BSDL для конкретного продукта MaxLinear пользователь должен ознакомиться со следующими ограничениями на использование. Если Пользователь не принимает эти условия, модель IBIS / BSDL для конкретного продукта MaxLinear не должна использоваться или загружаться.

Пользователю предоставляется эта лицензия только на использование модели IBIS / BSDL для конкретного продукта MaxLinear для внутреннего использования, и ему не предоставляются права на продажу, ссуду, аренду, аренду или лицензирование модели IBIS / BSDL для конкретного продукта MaxLinear в полностью или частично или в измененной форме кому-либо, кроме Пользователя.Пользователь может изменять модель IBIS / BSDL для конкретного продукта MaxLinear в соответствии со своими конкретными приложениями, но права на производные работы и такие модификации принадлежат MaxLinear.

Эта модель IBIS / BSDL для конкретного продукта MaxLinear предоставляется на условиях «КАК ЕСТЬ», и MaxLinear не дает абсолютно никаких гарантий в отношении информации, содержащейся в данном документе. MaxLinear ОТКАЗЫВАЕТСЯ И ПОЛЬЗОВАТЕЛЬ ОТКАЗЫВАЕТСЯ ОТ ВСЕХ ГАРАНТИЙ, ЯВНЫХ ИЛИ ПОДРАЗУМЕВАЕМЫХ, ВКЛЮЧАЯ ГАРАНТИИ КОММЕРЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ИЛИ ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕННОЙ ЦЕЛИ.Весь риск, связанный с качеством и производительностью, лежит на Пользователе. Соответственно, компания MaxLinear НИ ПРИ КАКИХ ОБСТОЯТЕЛЬСТВАХ НЕ НЕСЕТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ЗА ЛЮБЫЕ УБЫТКИ, ВКЛЮЧАЯ ЛЮБЫЕ УПУЩЕННЫЕ ПРИБЫЛИ ИЛИ ДРУГИЕ СЛУЧАЙНЫЕ, КОСВЕННЫЕ, ПРИМЕРНЫЕ ИЛИ КАРАТНЫЕ УБЫТКИ, ВОЗНИКАЮЩИЕ В РЕЗУЛЬТАТЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ / ПРИМЕНЕНИЯ ПРОДУКЦИИ MaxLinear. BSDL. Кроме того, MaxLinear оставляет за собой право вносить изменения без предварительного уведомления для повышения надежности, функциональности или дизайна. MaxLinear не передает никаких лицензий в соответствии с патентными правами или любыми другими правами интеллектуальной собственности, включая права третьих лиц.

MaxLinear не обязана обеспечивать обслуживание или поддержку модели IBIS / BSDL для конкретного продукта MaxLinear.

Страница не найдена — Colorado Time Systems